克侖特羅（clenbuterol，CLE）是一種腎上腺受體激動劑即神經(jīng)興奮劑，在臨床上用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進動物生長，被一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖促進劑非法使用。其殘留量可導(dǎo)致人體肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，對消費者的健康極有危害�，F(xiàn)已被明令禁止用于養(yǎng)殖業(yè)。HPLC或GC-MS一直用作檢測β興奮劑的方法，但是其前處理步驟費用昂貴。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒則可經(jīng)濟、快速地檢測尿，肌肉，肝臟及飼料中的CLE。

測定原理：

測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對CLE的兔抗體。經(jīng)過洗滌步驟后，加入CLE酶標記物，標準或樣品溶液。CLE與CLE-酶標記物競爭抗體，沒有連接的CLE-酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶反應(yīng)底物（過氧化尿素）和顯色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標記物將無色的顯色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的CLE濃度成反比。

提供的試劑（2-8℃保存）切勿冷凍

每一個盒中的試劑足夠進行96個測量（包括標準分析孔），盒中的材料如下：

1×96孔板（12條×8孔）包被有兔IgG抗體

6×標準液， (2ml)為分別含0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb 的CLE水溶液

1×CLE過氧化物酶標記物濃縮溶液

1×酶反應(yīng)底物（6ml）；含有過氧化尿素

1×顯色劑（6ml）;四甲基聯(lián)苯胺

1×反應(yīng)停止液（7ml）；1M 硫酸

1×PBS (10ml), 用于稀釋CLE-過氧化物酶標記物濃縮溶液

1×PBST濃縮液(40ml)，加800ml蒸餾水稀釋，洗板用

樣品處理：

樣品處理方法1：

組織、肉樣（純精肉）、內(nèi)臟樣品的處理方法:

１．稱2克勻漿過的樣品加入2 mL溶液１(無色無味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。

2. 加入6 ml溶液2(淡黃色,具刺激性氣味)，推薦用干凈的衛(wèi)生筷或竹簽攪拌樣品5分鐘；或振蕩15分鐘，使其均勻分布于溶液中。

3．3000g離心10分鐘。

4. 取3ml上清液于干凈平皿中,60℃恒溫箱蒸干(30分鐘左右)；也可在試管中直接水浴加熱蒸干。

5．殘留物用1ml 溶液2 (無色無味) 沖洗溶解。

6．3000g離心10分鐘。

7．取清亮中間部分50ul直接加樣, ELISA進行分析。

注：如果不慎將溶液弄到皮膚上，請立即用７５％的醫(yī)用酒精棉花擦拭，并用清水沖洗。切勿飲用及濺入眼睛。

樣品處理方法2 （更快速）：

1、稱2克勻漿過的樣品加入2 mL溶液１(無色無味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。

2、加入4mL溶液2 (淡黃色,具刺激性氣味)，強烈振蕩，肉樣約2分鐘，組織約6分鐘。

3、3000g離心5分鐘。

4、取1 ml上清液于干凈平皿中，70℃~80℃恒溫箱蒸干(約需5分鐘左右)�；蛴秒姶碉L，只需3分鐘。

5、殘留物用0.5 ml 溶液3 (無色無味) 沖洗，將底部白色殘留物全部洗入溶液。

6、取洗脫液50ul作檢測用。

酶標免疫分析程序：

1. 測定之前注意事項

a) 使用之前將所有試劑回升至室溫20-25℃

b) 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃

c) 在使用中不要讓微孔干燥

d) 在ELA分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是ELA測定程序中的要點

e) 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板

2.酶標記物與微孔板條

a) CLE- 酶標記物提供的CLE- 酶標記物為濃縮液。由于稀釋的酶標記物穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實際需用量的酶標記物1：14稀釋（1μl酶標液加14μlPBS）。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，剩余的仍放置2-8℃保存。

b)微孔板條取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板用膠帶封好，放進原袋中重新密封，4℃或-20℃保存，謹防受潮。

3. 標準液提供的CLE標準液濃度為0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb(ng/ml)

4. 測定程序（室溫25℃條件下操作）

a) 剪開鋁箔袋，將足夠標準和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。加入20μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔中。如果微孔板條一次實驗用不完，放回原鋁箔袋中封緊，最好再套一個塑料自封袋夾緊后4℃或-20℃保存，切忌受潮。

b) 加入100μl稀釋的酶標記物到微孔底部，25℃孵育30分鐘（推薦使用恒溫箱）。

c) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250μl PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作兩次。每次洗板應(yīng)加入洗液后等2分鐘再倒掉。推薦使用洗瓶洗板，這樣可加快速度，避免板條間的孵育時間不一致而產(chǎn)生OD值的差異。

d) 反應(yīng)底物與顯色試劑以1：1混合后加入100μl到微孔中，充分混合并在25℃暗處孵育15分鐘。

e) 加入50μl反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450nm 處測量吸光度值，必須在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。

結(jié)果：

所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，因此0標準等于100%并且以百分比的形式給出吸光度值。

標準的吸光度值（或樣品）

----------------------- ×100 = %吸光度值

0標準的吸光度值

計算的標準值繪成為一個對應(yīng)CLE濃度（ng/g,或ng/ml）的半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.2-2ng/g(ppb)范圍內(nèi)應(yīng)當成為線性。相對應(yīng)每一個樣品的濃度（ng/g, 或ng/ml）可以從校正曲線上讀出。

靈敏度：

克倫特羅測定試劑盒的平均檢測下限約為0.1ng/g（0.1ppb）。

特異性：

與克倫特羅類似物的交叉反應(yīng)：